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博士生一年级戚懿予

研究背景

M1巨噬细胞通过感知微生物成分（如脂多糖）和损伤组织释放的损伤相关分子模式，引发对感染和组织损伤的快速促炎反应。相比之下，IL-4和IL-13诱导的M2巨噬细胞显示出抗炎和修复活性，以解决炎症和促进组织修复。巨噬细胞被认为最初在感染中参与M1表型，协调宿主免疫，然后获得M2表型来抑制促炎反应和修复受损组织。然而，巨噬细胞的激活解除和表型转换会导致对感染的无效免疫反应和严重的组织损伤。例如，未能抑制巨噬细胞对全身细菌感染的反应中促炎细胞因子的过度产生，导致脓毒性休克，并伴有组织和器官损伤。相比之下，在最初感染后，对M1激活的长期限制会使免疫系统瘫痪，无法抵抗随后的微生物感染。因此，巨噬细胞中复杂的调节网络对于指导感染、细胞因子环境和其他微环境线索中的激活至关重要。

M1巨噬细胞和M2巨噬细胞的生物能需求的差异作为调节回路出现，调节巨噬细胞的行为以响应其住所和感染组织中的营养状态。M1巨噬细胞依靠有氧糖酵解来产生ATP，增加葡萄糖和谷氨酰胺的消耗，但它们抑制氧化代谢。M1巨噬细胞具有断裂的三羧酸（TCA）循环，使得柠檬酸和琥珀酸积累。积累的柠檬酸可用于生产脂肪酸和衣康酸（一种抗菌分子）。琥珀酸作为一种促炎代谢物，通过抑制脯氨酰羟化酶（PHD）活性和促进活性氧（ROS）产生来稳定转录因子HIF-1α。相比之下，M2巨噬细胞维持完整的TCA循环，并有利于氧化代谢，特别是脂肪酸氧化（FAO），作为一种模式的三磷酸腺苷生产。类似于阻断电子传递链（ETC）活性，对溶酶体脂肪分解或脂肪酸氧化的抑制会损害IL-4诱导的抗炎反应和M2巨噬细胞的修复能力，这表明氧化磷酸化（OXPHOS）和FAO控制M2活化的调节回路。M2巨噬细胞比原始巨噬细胞消耗更多的葡萄糖和谷氨酰胺。这种糖酵解代谢通过产生脂肪酸为FAO提供燃料并作为表观遗传重编程的乙酰辅酶A供体来增强M2活化。

然而，谷氨酰胺代谢如何支持M2活化仍不清楚。最重要的是，通过代谢靶向来微调解除调节的巨噬细胞活化的治疗潜力仍在很大程度上未被探索。

年7月17日，Pu-SteLiu等人在natureimmunology杂志发表题为a-ketoglutarateorchestratesmacrophageactivationthroughmetabolicandepigeneticreprogramming（IF：20.）的研究成果表明，谷氨酰胺分解产生的αKG通过Jmjd3依赖性代谢和表观遗传重编程促进M2活化。相反，αKG通过蛋白激酶IKKβ的PHD依赖性脯氨酸羟基化抑制核因子κB途径，从而损害M1巨噬细胞的促炎反应。此外，在脂多糖刺激期间由谷氨酰胺分解产生的αKG在促进脂多糖诱导的内毒素耐受中具有关键作用。

01aKG调节巨噬细胞极化

为了研究谷氨酰胺代谢是如何调节巨噬细胞活化的，他们首先确定了谷氨酰胺剥夺对用白介素-4或脂多糖处理的小鼠骨髓源性巨噬细胞的影响。如以前的研究所述，谷氨酰胺剥夺损害了M2特异性标记基因的表达，包括Arg1、Ym1(Chil3)、Retnla和Mrc1，并抑制了精氨酸酶1的活性(图1a，b)。相反，在脂多糖刺激下，缺乏谷氨酰胺的骨髓基质细胞比在谷氨酰胺充足条件下激活的骨髓基质细胞显示出更高的M1特异性标记基因表达，包括Il1b、Tnf、Il6和Il12(Il12b)(图1c)。因为谷氨酰胺主要被分解代谢为αKG，αKG通过谷氨酰胺赖氨酸进入TCA循环补充TCA循环中间体，他们评估了原始和LPS-和IL-4刺激的BMDMs的转录组，以确定参与谷氨酰胺分解和αKG代谢的基因的表达。用脂多糖而不是白细胞介素-4处理抑制了促进αKG产生的基因的表达(图1d)。为了测试谷氨酰胺是否通过产生αKG促进M2但抑制M1活化，他们用BPTES(谷氨酰胺酶1的抑制剂)治疗BMDMs，以在IL-4或LPS刺激17期间，在缺乏或存在二甲基αKG(αKG的细胞渗透性类似物)的情况下抑制谷氨酰胺分解。用BPTES处理抑制了白细胞介素-4处理的BMDMs中M2特异性基因的表达和精氨酸酶1的活性，但添加DM-αKG恢复了M2表型(图1e，f)。相比之下，BPTES治疗促进了LPS刺激的BMDMs中促炎基因的表达和细胞因子的产生，并且DM-αKG的存在削弱了这种诱导(图1g，h)。总之，这些结果表明谷氨酰胺分解产生的αKG对支持巨噬细胞的抗炎表型至关重要。

02谷氨酰胺分解支持M2巨噬细胞的代谢重编程

M2活化诱导代谢重塑以促进氧消耗并驱动氧化磷作为三磷酸腺苷产生的主要模式。然而，决定氧化磷在M2巨噬细胞中参与的代谢控制点是未知的。为了研究谷氨酰胺代谢是否提供了这样的代谢控制点，他们使用海马细胞外流量分析仪测定了白细胞介素-4刺激的BMDMs的耗氧率。不出所料，白细胞介素-4处理的BMDMs显示出比未处理的BMDMs更高的备用呼吸能力（SRC）。尽管白细胞介素-4治疗没有增加缺乏谷氨酰胺的BMDMs的SRC，但添加DM-αKG允许缺乏谷氨酰胺的BMDMs获得这种代谢变化(图2a，b)，表明αKG是谷氨酰胺分解产生的代谢控制点，以支持M2巨噬细胞的代谢重编程。他们接下来研究了αKG是否通过选择性地增强特定的营养介导的OXPHOS，使用UK(阻断丙酮酸的线粒体输入)或etomoxir(抑制FAO)来处理BMDMs。白细胞介素-4刺激和谷氨酰胺剥夺不影响巨噬细胞中丙酮酸依赖的OCR(图2c，d)。相比之下，在谷氨酰胺充足的情况下，白介素-4治疗显著增强了FAO依赖性OCR。在缺乏谷氨酰胺的BMDMs中，白细胞介素-4刺激不能诱导FAO依赖性OCR，但通过补充DM-α-KG可以恢复(图2e，f)，这表明α-KG是调节FAO参与M2巨噬细胞的调节剂。此外，他们发现M2激活促进肉碱棕榈酰转移酶1a(Cpt1a)的表达，Cpt1a是FAO的限速酶，并以αKG依赖的方式增加脂肪酸摄入的速率(图2g，h)。总之，这些结果表明谷氨酰胺代谢是通过αKG介导的调节支持M2巨噬细胞代谢重编程的关键。

03M2极化依赖于AkG-Jmjd3途径

接下来检测了组蛋白H3K27(H3K27M3)的三甲基化，这是一种抑制M2标记基因表达的表观遗传标记，位于M2标记基因Arg1,Ym1,Retnla和Mrc1的启动子上。白细胞介素-4处理以谷氨酰胺依赖的方式降低了这些基因启动子上的H3K27me3(图3a)，这表明谷氨酰胺代谢可能通过促进H3K27的去甲基化来支持M2活化。鉴于Jmjd3是H3K27去甲基化的关键酶，并通过表观遗传调控控制M2活化，他们询问谷氨酰胺代谢是否通过促进M2特异性标记基因启动子上的Jmjd3依赖性H3K27去甲基化来支持M2活化。在缺乏谷氨酰胺的BMDMs中，DM-αKG促进了H3K27me3的丢失，并且在存在谷氨酰胺或DM-αKG的情况下，用GSK-J4(一种Jmjd3选择性抑制剂)处理抑制了H3K27的去甲基化(图3b)。这表明谷氨酰胺代谢产生的αKG通过Jmjd3依赖性表观遗传重编程促进M2活化。为了进一步测试DM-αKG是否以Jmjd3依赖的方式增强M2激活，他们转导了来自小鼠的BMDMs，其中Cas9在巨噬细胞(LysM-CreCas9小鼠)中选择性表达，该巨噬细胞含有针对Jmjd3的单导向RNAs(sgRNAs)，或者分别加扰sgRNAs以产生Jmjd3缺陷的BMDMs或对照BMDMs。Jmjd3缺陷型BMDMs的Jmjd3表达低于对照BMDMs，DM-αKG处理在Jmjd3缺陷型BMDMs中不促进M2特异性基因表达或精氨酸酶1活性(图3c，d)。此外，补充谷氨酰胺或DM-αKG不会增加Jmjd3缺乏的BMDMs中H3K27me3的去甲基化(图3e)。接下来，他们比较了IL-4诱导的基因的表达，包括Ccl22、Hr、Il4i1和Irf4，据报道它们被谷氨酰胺剥夺所抑制。谷氨酰胺的缺乏抑制了这些基因的表达，补充DM-αKG使其在BMDMs中得以恢复。然而，补充谷氨酰胺或DM-αKG并不能促进Jmjd3缺陷型BMDMs中这些基因的表达(图3f)。接下来，他们发现在谷氨酰胺或DM-αKG存在的情况下，JmD3缺乏的BMDMs不会增加对IL-4的氧消耗(图3g，h)，这表明αKG-JmD3信号通路负责M2巨噬细胞的代谢重编程。总之，这些结果表明，αKG-Jmjd3途径作为一个代谢控制点，通过谷氨酰胺代谢支持巨噬细胞M2激活。

04aKG/琥珀酸比值调节巨噬细胞活化

αKG是Jmjd3的共刺激因子，琥珀酸是抑制剂；因此，高αKG/琥珀酸比率诱导H3K27的Jmjd3依赖性去甲基化，以支持胚胎干细胞的多能性。为了测试αKG/琥珀酸比率是否调节巨噬细胞活化，他们测量了幼稚、M1和M2BMDMs的αKG/琥珀酸比率，发现与脂多糖处理相比，白细胞介素-4刺激导致更高的αKG/琥珀酸比率(图4a)，表明αKG脱氢酶活性的调节在M1巨噬细胞和M2巨噬细胞之间可能不同，以影响αKG转化为琥珀酸并建立不同的αKG/琥珀酸比率。事实上，脂多糖刺激的BMDMs显示出比白细胞介素-4处理的BMDMs更高的αKG脱氢酶活性(图4b)，这表明M2巨噬细胞可能通过抑制αKG脱氢酶活性来促进αKG积累。为了进一步检查α-KG/琥珀酸酯比率是否影响M2激活，他们在增加剂量的DM-αKG的情况下，用固定浓度的琥珀酸二乙酯(一种细胞可渗透的琥珀酸酯)处理缺乏谷氨酰胺的BMDMs。以这种方式增加αKG/琥珀酸比率促进了M2特异性标记基因表达(图4c)。相比之下，尽管琥珀酸二乙酯作为促炎代谢物来刺激LPS处理的巨噬细胞中Il1b基因的表达和细胞因子的产生，但用增加剂量的DM-αKG处理逐渐消除了BMDMs中Il1b的表达(图4d)。此外，增加剂量的琥珀酸二乙酯损害了DM-αKG诱导的M2标记基因表达(图4e)。然而，琥珀酸二乙酯不能恢复DM-αKG处理的巨噬细胞中IL-1β的表达(图4f)。总之，这些数据表明，αKG/琥珀酸比率影响巨噬细胞极化程序，对该比率的操纵可能允许定制巨噬细胞免疫反应。

05aKG抑制IKKb激活

他们测试了αKG是否通过抑制负责M1激活的保守上游信号来抑制促炎细胞因子的产生。BMDMs中的谷氨酰胺剥夺和BPTES处理都促进转录因子NF-κB的核易位以响应LPS处理，这是驱动广泛促炎功能的基本事件(图5a)。此外，在缺乏谷氨酰胺的BMDMs中，DM-αKG抑制核因子-κB的核转位(图5b)。通过聚合酶链反应阵列评估，在脂多糖刺激的BMDMs中，补充DM-αKG抑制了许多核因子-κB信号靶点的表达，如Cd80和Sele，但在对照细胞中却没有(图5c)，这表明来源于谷氨酰胺分解的αKG可能通过抑制核因子-κB信号通路而抑制促炎反应。因为αKG可以通过激活PHD酶（脯氨酰羟化酶）干扰细胞功能，他们研究了αKG是否以PHD依赖的方式抑制M1特异性标记基因的表达。二甲基草酰甘氨酸(DMOG)是PHD活性的抑制剂，其治疗恢复了DM-αKG治疗的骨髓间充质干细胞中M1标记基因的表达(图5d)。脂多糖刺激的BMDMs经BPTES治疗后，磷酸化IKK的数量增加，而DM-αKG则减少磷酸化IKK的数量(图5e)。与DMOG的联合治疗恢复了DM-αKG处理的骨髓间充质干细胞的IKK磷酸化，表明DM-αKG通过增强PHD活性来阻止IKK活化。据报道，PHD通过P上IKKβ的羟基化来抑制IKKβ的活化。他们接下来在BMDMs中过量表达野生型IKKβ或PA-IKKβ，一种不能被PHD羟基化的脯氨酸-丙氨酸取代突变体，并用LPS处理它们。与未转导的BMDMs和过度表达野生型IKKβ的BMDMs相比，DM-αKG在用PA-IKKβ转导的BMDMs中不抑制LPS诱导的M1标记基因表达(图5f)。类似地，通过流式细胞术，DM-αKG没有抑制PA-IKKβ转导的BMDMs中脂多糖诱导的核因子κB的核易位(图5g，h)。这些结果表明αKG在通过PHD介导的IKKβ翻译后修饰干预核因子κB途径来限制M1活化中的作用。

06起始期谷氨酰胺分解调节内毒素耐受性

巨噬细胞对谷氨酰胺的摄取被脂多糖处理大大增强，而暴露于脂多糖诱导内毒素耐受，其中巨噬细胞在急性反应解决后对随后的暴露产生抗性，以防止过度的促炎反应。为了测试谷氨酰胺代谢在最初的脂多糖激活期间的参与是否有助于建立内毒素耐受性，在第一次脂多糖引发期间剥夺了BMDMs的谷氨酰胺，然后用脂多糖再次刺激它们来检测促炎基因的产生，包括Il1b、Tnf、Il6和Il12。在缺乏谷氨酰胺的条件下，与在富含谷氨酰胺的条件下启动的BMDMs相比，在缺乏谷氨酰胺的条件下启动的巨噬细胞显示出高表达的促炎基因(图6a)，这表明LPS诱导的内毒素耐受性需要谷氨酰胺。在LPS引发期间用DM-αKG处理的缺乏谷氨酰胺的BMDMs显示了在再次暴露于LPS时促炎基因表达的抑制(图6b)。然而，DE-Suc治疗不能恢复缺乏谷氨酰胺的巨噬细胞的内毒素耐受性(图6c)，这意味着αKG促进内毒素耐受性，而不依赖于其转化为琥珀酸。内毒素不耐受的巨噬细胞还表达组织修复和抗微生物基因。在富含谷氨酰胺的培养基中，或在含或不含DM-αKG的含谷氨酰胺的培养基中，用LPS引发的BMDMs的RNA测序进行整体基因表达模式的比较表明，谷氨酰胺剥夺改变了LPS处理的BMDMs中超过个基因的表达模式，并且补充DM-αKG恢复了该组中个基因的表达模式(图6d)。此外，基因簇分析显示，由αKG和谷氨酰胺代谢调节的那些基因控制涉及炎症反应、外体释放和线粒体活性的生物过程(图6e)。以上结果表明，谷氨酰胺在M1活化过程中的代谢作为一个代谢检查点，诱导内毒素耐受，并调节与巨噬细胞内毒素耐受相关的转录水平。

07谷氨酰胺的分解损害巨噬细胞的NF-kB通路

接下来，检测了核因子-κB信号通路负调节因子的表达，这种负调节因子已知能诱导内毒素耐受性。与富含谷氨酰胺的培养基培养的BMDMs相比，缺乏谷氨酰胺的BMDMs在脂多糖引发期间表达的这些调节因子的量较低。值得注意的是，这种现象是通过DM-αKG治疗预防的(图7a)。此外，在脂多糖引发期间，剥夺谷氨酰胺和给予BPTES，能使BMDMs在再次暴露于脂多糖时维持核因子κB的核易位(图7b)。相比之下，DM-αKG治疗降低了缺乏谷氨酰胺的BMDMs在用脂多糖再次攻击时增强核因子κB核易位的能力(图7c)。这些结果表明，αKG通过影响核因子-κB介导的转录事件来调节内毒素耐受。因为LPS启动可以刺激Jmjd3表达，并且Jmjd3促进IRF4的表达，IRF4是建立内毒素耐受的重要调节因子，所以测试了αKG-Jmjd3途径是否调节内毒素耐受的建立。补充谷氨酰胺和DM-αKG处理增加了一些基因的表达，包括Arg1、Mmp9和Mrc1，这些基因在内毒素耐受的对照BMDMs中调节修复活性，但在Jmjd3缺陷的BMDMs中不增加(图7d)，这表明它们由DM-αKG诱导是Jmjd3依赖性的。总之，这些数据表明巨噬细胞谷氨酰胺代谢产生的αKG通过促炎基因和修复基因的不同机制控制内毒素耐受性的诱导。为了进一步评估由谷氨酰胺代谢调节的内毒素耐受性的生理相关性，他们给小鼠预先注射PBS、低剂量的脂多糖或低剂量的脂多糖加BPTES来诱导内毒素耐受性，然后他们在18小时后用致死剂量的脂多糖重新攻击小鼠。如预期的那样，由于内毒素耐受性的建立，预先暴露于脂多糖导致存活时间延长，而用BPTES治疗取消了内毒素耐受性诱导的保护作用(图7e)。然而，在初次注射脂多糖和BPTES的基础上加入DM-αKG显著提高了存活率(图7f)。由于BPTES和DM-αKG治疗可能会影响这些试验中的多种细胞类型，所以在第一次脂多糖攻击前注射氯膦酸盐脂质体以耗尽小鼠巨噬细胞和单核细胞中内毒素耐受性的诱导。在初次注射脂多糖期间使用或不使用DM-αKG的BPTES治疗导致了与对照载体治疗相似的存活率(图7g)，这表明靶向巨噬细胞中的谷氨酰胺代谢可能调节体内内毒素耐受的诱导，正如他们在这里观察到的。综上所述，这些结果表明，谷氨酰胺在M1激活过程中的代谢通过影响核因子κB介导的转录调节，作为诱导内毒素耐受性的代谢调控点。

结论与展望

1.谷氨酰胺分解产生的αKG是一种抗炎代谢产物，它通过JmJD3依赖性调节增强M2活化并控制M2巨噬细胞的代谢重编程。

2.谷氨酰胺代谢通过αKG-PHD依赖机制调节IKKβ活性来阻碍核因子κB途径，从而限制M1活化。

3.靶向谷氨酰胺代谢可以防止内毒素耐受的诱导并维持巨噬细胞的促炎潜能。

鉴于αKG是PHD酶的激活剂，抑制谷氨酰胺分解可以抑制αKG的产生，因此值得进一步研究谷氨酰胺酶抑制如何影响肿瘤微环境中T细胞的抗肿瘤反应。

稿件审阅：张启春老师

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