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文章亮点：

该研究发现一种蛋白质-富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SecretedProteinAcidicAndCysteineRich，SPARC）可以对肌腱和韧带受到的压力做出反应，并对负荷诱导下肌腱稳态有调节作用。研究首次发现了影响肌腱和韧带的遗传因素，这将有助于在未来改善病人的护理，更重要的是可帮助那些从事运动的人，以及如何预防肌腱和韧带受伤。

文章引言：

肌肉骨骼疾病(MSDs)对患者残疾和死亡率的影响最大，影响所有年龄的人，肌腱和韧带损伤发生在连接肌肉和关节的软组织中，是最常见的肌肉骨骼损伤之一。肌腱和肌腱界面的再生能力非常有限，这使得它们的损伤在临床上很难解决。肌腱能感受来自肌肉介导的负荷，然而现有的研究对于外部负荷究竟如何影响生理和病理状态下肌腱的适应机制，知之甚少。

文章结果：

图1：Sparc-/-小鼠显示肌腱的发育不良表型。首先对比WT鼠和Sparc-/-鼠的肌腱表型，发现Sparc-/-小鼠主要是在髌腱、屈肌腱和跟腱有发育不良的表型，但是在小鼠尾部肌腱中无明显差异（1A），且小鼠尾部肌腱的HE染色（1B）和尾部腱束定量（1C）也证明了尾部肌腱无明显差异；随后用GFP荧光标记屈肌腱，发现在出生后18（P18）天，WT鼠和Sparc-/-小鼠大小无明显差异（1D）；随后通过组织学发现在P10天WT鼠和Sparc-/-小鼠肌腱形态相当，P21天观察到髌骨发育发育不良（1E）；用RT-qPCR对肌腱相关基因进行检测，进一步证实了在P21天时Sparc-/-小鼠的编码腱原性转录因子巩膜轴(Scx)、Mohawk(Mkx)和早期生长反应1(Egr1)的mRNAs以及编码细胞外基质蛋白Col1a1的基因显著减少，这些结果表明SPARC缺失对胚胎和出生后早期肌腱发育没有显著影响，但会影响出生后后期的肌腱生长。

图2：Sparc-/-小鼠的跟腱附着点生物力学较差。为了进一步检查SPARC缺失是否也影响肌腱组织界面，接下来研究了跟腱附着点的出生后P7、P14、P21和2个月的发育情况。发现SPARC是随着时间发育表达慢慢减少，且在2个月时，SPARC的最高表达在外基质中观察到(2A和B)；胶原染色显示从P14开始，WT和Sparc-/-小鼠的胶原蛋白成熟(2C)，但是在2月龄的WT鼠中，观察到完全成熟的胶原，而Sparc-/-小鼠大部分为不太成熟胶原；2D图对两种小鼠进行机械测试，发现Sparc-/-小鼠的最大拉伸应力明显低于WT鼠，但是u-CT结果（2E和F）发现Sparc-/-小鼠和WT鼠的肌腱插入表面积无明显变化，说明肌腱插入处的跟骨的特点是总体积(BV/TV)和结构厚度的骨体积较低，表明骨质量受损。

图3：SPARC的缺失会导致末端纤维软骨（FC）形成延迟。由于纤维软骨过渡区的形成对正常的跟腱止点功能是必不可少的，随后测定了跟腱止点的纤维软骨面积(3A和B)，发现Sparc-/-小鼠出生后P14天才开始有纤维软骨的形成，形成时间明显低于WT鼠；3C图的番红快绿染色观察到次级骨化中心的形成时间Sparc-/-小鼠比WT鼠形成时间晚，Sparc-/-小鼠的纤维连接蛋白的形成在P14(图3D)，说明在Sparc小鼠中，FC区和次级骨化中心的形成在出生后早期发育中被延迟。

图4：跑步机训练导致Sparc-/-小鼠自发性跟腱断裂。由于Sparc-/-小鼠在肌肉介导的负荷开始后的出生后发育过程中显示出肌腱和肌腱组织界面的损伤，我们接下来通过强制跑步机跑步实验来检查功能性肌腱质量。在11±0.7天的训练后，在Sparc-/-小鼠中观察到跑步过程中的脚外翻，而在WT小鼠中没有一只显示出脚位置的变化(图4A)。后肢的u-CT(图4B)显示部分或全部跟腱断裂。此外，通过u-CT进行的肌腱组织体积量化显示，14天训练后，与WT动物相比，Sparc-/-小鼠的肌腱组织体积显著减少(图4C)。这些结果表明，在Sparc-/-小鼠中，高强度的机械负荷导致自发性跟腱断裂。

图5：负荷剥夺预防Sparc-/-小鼠肌腱发育不良。为了研究了出生后早期发育中负荷剥夺对Sparc-/-小鼠肌腱组织形成的影响，进行了肉毒杆菌毒素A（导致肌肉收缩力的损失和髌腱负荷的减少）注射到股四头肌的右侧股外侧肌，组织学分析WT和Sparc-/-鼠的瘫痪后肢肌腱厚度相当(图5A)，WT小鼠治疗后髌腱变薄；而sparc-/-小鼠后肢的髌腱明显更厚(图5B)，接受肉毒杆菌注射的WT和Sparc-/-小鼠后肢的细胞密度相当(图5C)。RT-qPCR分析显示，WT治疗组和Sparc-/-治疗组的肌腱相关mRNA(Scx、Mkx和Col1a1)水平相当。相反，在NC组中，Scx和Mkx的表达相对于Sparc-/-小鼠的治疗组有所降低(图5D)。这些结果进一步表明SPARC对负荷诱导的肌腱成熟和体内平衡至关重要。

图6：在机械负荷下，Sparc的丧失减弱了S6K的激活并减少了I型胶原的产生。为了探索肌腱成熟变化的分子途径，体外用单轴拉伸生物反应器来检测机械负荷对WT和Sparc-/-小鼠成的三维(3D)肌腱构建体的影响。两种肌腱都形成了3D肌腱结构，与未加载的对照相比，导致基质中的胶原纤维更加排列整齐(图6A)。对受机械负荷影响的潜在信号通路的检查表明，从AKTT的磷酸化上看单轴负荷导致两种构建体的AKT活化相当，但是pS6KT的磷酸化对于WT比Sparc-/-构建体更显著，且I型胶原的表达显著降低(图6B)。随后在加力途中用hrSPARC蛋白进行了挽救实验发现外源性hrSPARC不影响整体AKT活化(pT)，但恢复了Sparc构建体中S6K磷酸化和I型胶原的产生(图6C)。此外，肌腱相关标记物Scx和Mkx的表达在加入rhSPARC抑制剂后显著增加(图6D)，表明了负荷诱导的S6K激活和肌腱中I型胶原的产生需要SPARC。

图7：需要较低的机械刺激来触发Sparc-/-肌腱中的钙反应。用机械负荷(0-10%应变)下WT和Sparc-/-尾腱束的定量Ca2+成像测Ca2+反应。虽然Sparc-/-纤维束显示出与WT纤维束非常相似的钙反应(图7A和B)，但Sparc-/-纤维束承受的机械载荷明显较低(图7D到F)，表明生物力学稳定性受损。因此，触发细胞反应所需的机械刺激在Sparc-/-腱中显著较低（7C）。表明肌腱中SPARC的丧失不会改变功能性Ca2+信号或腱细胞的机械感知能力，但会通过改变细胞外基质的生物力学特性使肌腱对感知载荷更加敏感。

图8：c.TG突变损害SPARC分泌和I型胶原纤维成熟。对名年轻患者进行了SPARC基因全外显子测序，发现有c.TG的点突变，该突变导致了半胱氨酸Cys突变为谷氨酸Gln，会导致SPARC内二硫键断裂（8A和B）；突变的SPARC中表达低于WT-SPARC（8C和D），且I型胶原纤维形成因此受阻（E和F）。表明二硫键的破坏导致SPARC分泌的强烈减少，并因此导致I型胶原纤维形成受损。

文章结论：

本研究发现缺乏SPARC的小鼠表现出肌腱稳态失调和肌腱组织界面形成受损。在通过AKT/S6K途径控制的机械负荷下，SPARC损失导致机械反应改变和胶原产生减少，最终导致承重肌腱受损，易于在体内自发肌腱断裂。研究发现的临床相关性通过在SPARC发现的一个杂合错义突变得到了强调，该突变与人类肌腱和韧带损伤有关，证明所鉴定的突变损害SPARC分泌，导致I型胶原产生受损，破坏了肌腱稳态。